![\"\"](\"https:\/\/veterinarska-stanica-journal.hr\/wp-content\/uploads\/2021\/06\/DamirPAVLICEK.jpg\")
<\/p>\n<\/p>\n
Damir Pavli\u010dek<\/strong>*, Nina Biland\u017ei\u0107<\/strong>, Ivana Tlak Gajger<\/strong> i Marija Den\u017ei\u0107 Lugomer<\/strong><\/p>\n <\/a><\/p>\n <\/a> ▲<\/a><\/p>\n Uporaba pesticida na poljoprivrednim usjevima \u010desto se zbog otrovanja povezuje s masovnim ugibanjem ili slabljenjem p\u010delinjih zajednica. Pesticidi iz skupine neonikotinoida, zahvaljuju\u0107i svojim karakteristikama visoke toksi\u010dnosti za kukce, odnosno niske za kralje\u017enjake, visoke u\u010dinkovitosti i sistemi\u010dne aktivnosti u biljkama, postala je najupotrebljivija vrsta insekticida u posljednjih 20 godina. U osnovnoj strukturi ovi pesticidi sadr\u017ee nitrometilensku, nitroiminsku ili cijanoiminsku funkcionalnu skupinu, a glavni predstavnik je imidakloprid, poslije glifosata drugi najprodavaniji pesticid na svijetu. Prema mehanizmu djelovanja, neonikotinoidi su agonisti postsinapti\u010dkog nikotin acetilkolinskog receptora u centralnom \u017eiv\u010danom sustavu kukaca, gdje blokadom prijenosa signala izazivaju dezorijentaciju, paralizu, ali i njihovo uginu\u0107e. Rezidue neonikotinoida prisutne su i u peludu i u nektaru biljaka, \u0161to je glavni izvor prirodne hrane za p\u010dele, koje ih skuplja\u010dkom aktivno\u0161\u0107u donose i pohranjuju u ko\u0161nicama. Sve ve\u0107i broj istra\u017eivanja opisuje kako koncentracije ovih insekticida negativno utje\u010du na pona\u0161anje i zdravlje zajednica medonosnih p\u010dela. Stoga je Europska Komisija na temelju izvje\u0161\u0107a o procjeni \u0161tetnosti ovih pesticida u protekle tri godine zabranila osim u staklenicima uporabu klotianidina, imidakloprida, tiametoksama i tiakloprida na svim otvorenim povr\u0161inama u zemljama \u010dlanicama Europske unije. Klju\u010dne rije\u010di:<\/strong> neonikotinidi, medonosne p\u010dele, otrovnost, rezidue<\/em><\/p><\/blockquote>\n <\/a> ▲<\/a><\/p>\n Kontinuirani porast svjetske populacije uzrok je velikih promjena u procesu poljoprivredne proizvodnje zbog sve ve\u0107e potrebe stanovni\u0161tva za hranom, ali i zadovoljavanje propisanih standarda njene kvalitete. Pesticidi se koriste kao dio suvremenih poljoprivrednih na\u010dela za\u0161tite poljoprivrednih nasada od \u0161tetnika. Pesticidi su toksi\u010dne tvari koje selektivno suzbijaju \u0161tetne organizme, ali zbog uo\u010denog nepovoljnog djelovanja i na neciljane biolo\u0161ke sustave i organizme, njihova toksi\u010dnost je vrlo opse\u017eno prou\u010davana (Abdollahi i sur., 2004., Lushchak i sur., 2018.). Iako rezultati toksikolo\u0161kih istra\u017eivanja upu\u0107uju na oksidativan stres kao mogu\u0107i na\u010din njihovog djelovanja, precizni mehanizmi putem kojih pesticidi djeluju na stani\u010dni metabolizam u ljudi jo\u0161 uvijek nisu u potpunosti razja\u0161njeni. Toksi\u010dni u\u010dinak obi\u010dno ovisi o kemijskoj strukturi pesticida, dozi i vremenu izlo\u017eenosti, ali u zaklju\u010dcima pojedinih istra\u017eivanja povezuje ih se s regulacijom apoptoze i redoks signalizacijom (Raszewski i sur., 2015., Jab\u0142o\u0144ska-Trypu\u0107, 2017.).<\/p>\n Pesticidi se prema svojoj namjeni mogu podijeliti u nekoliko skupina, no bilo da se radi o insekticidima, herbicidima ili nekoj tre\u0107oj podvrsti ovih kemijskih tvari, njihova pro\u0161irena uporaba rezultira one\u010di\u0161\u0107enjem prirodnih ekosustava (biljni i \u017eivotinjski svijet, podzemne, povr\u0161inske i izvorske vode, tlo, zrak). Shodno tome, na udaru su i p\u010dele, kukci zaslu\u017eni za opra\u0161ivanje oko 80 % biljaka cvjetnica i koji zajedno s drugim kukcima, opra\u0161uju vi\u0161e od 70 % usjeva koji \u010dine hranu za ljude. Poseban naglasak pridaje se pesticidima iz skupine neonikotinoida, relativno novijoj skupini sistemskih insekticida koju karakterizira dobra u\u010dinkovitost pri za\u0161titi poljoprivrednih kultura od \u0161tetnika. Iako su 1990-tih godina svjetskim tr\u017ei\u0161tem insekticida dominirale najva\u017enije kemijske klase spojeva (karbamati, organofosfati i piretroidi), danas neonikotinoidi zauzimaju gotovo tre\u0107inu tr\u017ei\u0161ta, pri \u010demu je imidakloprid najprodavaniji insekticid ili iza glifosata drugi najprodavaniji pesticid, s registriranom uporabom u vi\u0161e od 120 zemalja (Jeschke i sur., 2011.). Karakteristike zbog kojih su ovi spojevi do\u017eivjeli golem tr\u017ei\u0161ni uspjeh svakako je \u0161iroko podru\u010dje u\u010dinkovitosti, sistemsko i translaminarno djelovanje, izra\u017eena rezidualna aktivnost i jedinstven mehanizam djelovanja. Nakon objavljivanja brojnih rezultata istra\u017eivanja koji su potvrdili rizi\u010dno i \u0161tetno djelovanje neonikotinoida na p\u010delarstvo i opravdano postojanje rizika za p\u010dele (Chauzat i sur., 2009., Krupke i sur., 2012.). Europska je agencija za sigurnost hrane (EFSA) 2013. godine objavila sveobuhvatno istra\u017eivanje radi ustvr\u0111ivanja stvarne opasnosti primjene ovih insekticida, \u010diji su rezultati bili osnova za privremeno ograni\u010davanje uporabe tri aktivne tvari za koje je utvr\u0111en visoki rizik za p\u010dele. Uredbom Komisije (EZ) br. 485\/2013 ustvr\u0111eno je kako se klotianidin, imidakloprid i tiametoksam vi\u0161e ne smiju koristiti ili se dopu\u0161ta njihova uporaba tek nakon cvatnje nasada biljaka samo za industrijsku primjenu, a u nekim kulturama za za\u0161titu sjemena, zemlji\u0161ta ili folijarni tretman (EC, 2013.). Nakon dono\u0161enja ovih odluka o ograni\u010denjima proizvodnje, prometa i uporabe nekih neonikotinoida zabilje\u017eene su uglavnom pozitivne reakcije, posebno iz ekolo\u0161kih organizacija i udru\u017eenja p\u010delara. Iako zabrana naj\u010de\u0161\u0107e kori\u0161tenih neonikotinoida predstavlja va\u017ean korak za preokretanje pada populacije p\u010dela u Europi i dalje se vode brojne rasprave oko uporabe ovih tvari i u ne postojanju alternative koja bi pokazala jednaku djelotvornost za brojne kombinacije usjeva i \u0161tetnika. Stoga postoje sumnje kako odre\u0111eni broj poljoprivrednika i dalje koristi zabranjene tvari uvozom istih iz zemalja koje nisu \u010dlanice EU i gdje su ovi proizvodi i dalje dostupni u slobodnoj prodaji.<\/p>\n Kako bi se za\u0161titila bioraznolikost i zdravlje ljudi vrlo je bitno pratiti rezidue insekticida rabljenih u poljoprivrednoj proizvodnji. Iz tog razloga razvijaju se visokoosjetljive i selektivne analiti\u010dke metode za odre\u0111ivanje niskih koncentracija rezidua neonikotinoida koji su uneseni u ko\u0161nice na ili u tijelu p\u010dela skuplja\u010dica i u p\u010delinjim proizvodima.<\/p>\n <\/a> ▲<\/a><\/p>\n Ve\u0107 stolje\u0107ima, poljoprivrednici upotrebljavaju vodene ekstrakte duhana s visokim koncentracijama nikotina za za\u0161titu poljoprivrednih usjeva od raznih \u0161tetnih kukaca. Sedamdesetih godina 20. stolje\u0107a objavljena su prva znanstvena istra\u017eivanja i razvoj insekticida na bazi nikotina koji se nazivaju neonikotinoidi. Prema kemijskoj strukturi neonikotinoidi se mogu razvrstati na molekule s ravnolan\u010danom strukturom (acetamiprid, dinotefuran, klotianidin i nitenpiram) i molekule s heterocikli\u010dkom strukturom gra\u0111enom od petero\u010dlanih i \u0161estero\u010dlanih prstenova \u2013 imidakloprid, tiakloprid i tiametoksam (Iwasa i sur., 2004.). \u010cesto se navodi podjela na N<\/em>-nitrogvanidine (imidakloprid, tiametoksam, klotianidin i dinotefuran), nitrometilene (nitenpiram) i N<\/em>-cijanoamidine (acetamiprid), a jo\u0161 se spominje kako imidakloprid, nitenpiram, acetamiprid i tiakloprid ve\u017ee zajedni\u010dki kloropiridinski dio, tiametoksam i klotianidin koji sadr\u017ee klorotiazolnu skupinu dok dinotefuran posjeduje tetrahidrofuransku funkcionalnu skupinu (Jeschke i sur., 2011.). Dio molekule gdje su vezane razne cijano-, nitro-, amino- ili metilne- skupine odgovoran je za odre\u0111ene biolo\u0161ke i farmakolo\u0161ke interakcije (farmakofori) te utje\u010de na insekticidnu aktivnost, otrovnost i brojna druga fizikalno-kemijska svojstva ovih spojeva. Razvoj neonikotinoida temeljen je upravo na tra\u017eenju heterocikla i farmakofora koji bi dodatno poja\u010dali insekticidnu aktivnost, ali je pritom potrebno voditi ra\u010duna o optimalnoj raspodjeli elektrona u farmakoforu potrebnu za vezanje insekticida za receptor i zadr\u017eavanju hidrofobnosti neonikotinoida, kako bi uspje\u0161no probio kroz za\u0161titni lipidni omota\u010d koji obavija centralni \u017eiv\u010dani sustav kukaca (Seifert, 2014.).<\/p>\n Osim sedam glavnih predstavnika ove skupine pesticida jo\u0161 je nekoliko spojeva klasificirano u neonikotinoide: flonikamid, flupiradifuron, sulfoksaflor, gvadipir, cikloksaprida i imidaklotiz (Giorio i sur., 2017.). Dok flupiradifuron i sulfoksaflor imaju vrlo sli\u010dan na\u010din djelovanja kao i ostali neonikotinoidi, flonikamid se iako ima druga\u010diji mehanizam djelovanja zbog svoje piridinske strukture tako\u0111er pripisuje ovim pesticidima (Thompson i sur., 2020.). <\/a> ▲<\/a><\/p>\n Neonikotinoidi u odnosu na ostale klase organskih insekticida posjeduju jedinstvena fizikalna i toksikolo\u0161ka svojstva; op\u0107enito imaju najni\u017ee log P vrijednosti (logaritam koeficijenta raspodjele koji opisuje ravnote\u017eu rapodjele otopljenog spoja izme\u0111u vode i organskog otapala koje se ne mije\u0161a s vodom) \u0161to je u skladu s njihovom izvanrednom sistemi\u010dnom aktivno\u0161\u0107u koju imaju i neki organofosfati i metilkarbamati, ali ne i mnogo lipofilniji organoklorini i piretroidi. S druge strane, neonikotinoidi i piretroidi imaju ve\u0107i faktor selektivnosti za kukce nego za sisavce u odnosu na organofosfate, metilkarbamate i organoklorine.<\/p>\n Neonikotinoidi su sistemi\u010dni insekticidi koji u biljci nakon apsorpcije vrlo brzo djeluju, \u010dak i pri niskim dozama, gdje se vaskularnim tkivima prenose kroz korijenje, stabiljku, li\u0161\u0107e, cvije\u0107e i plodove (Bonmatin i sur., 2015.). Jednom kad ih kukac proguta, neonikotinoidi se ireverzibilno ve\u017eu s nikotinskim acetilkolinskim receptorima (nAChR) i oda\u0161ilju \u017eiv\u010dani signal na sli\u010dan na\u010din kao \u0161to to radi i acetilkolin. Neonikotinoidi, u svojoj strukturi, imaju nitro-, cijano- ili ekvivalentni farmakofor, umjesto jednostavno protoniraju\u0107eg atoma du\u0161ika, \u0161to im daje koplanarnu strukturu izme\u0111u tog vrha molekule i supstituiranog gvanidinskog ili amidinskog dijela (Tomizawa i sur., 2003.). Gvanidinski dio molekule imidakloprida ima pKa vrijednosti 1,56 za protonaciju i 11,12 deprotonaciju, \u0161to ukazuje na samo 2×10-4<\/sup> % protoniranja pri fiziolo\u0161kom pH. Ta koplanarnost omogu\u0107uje bolje i \u010dvr\u0161\u0107e vezanje putem konjugiranog elektronskog sustava koji olak\u0161ava protok negativnog naboja prema elektronegativnom kraju. Visok afinitet i selektivnost za receptore kukaca sadr\u017ean je u nitrozo (C=N-N-O) analozima neonikotinoida sugeriraju\u0107i va\u017enost du\u0161ika N1 i samo jednog elektronegativnog atoma kisika O1 za neonikotinoidno djelovanje (Slika 2).<\/p>\n Udaljenost izme\u0111u dvaju atoma je 5,45-6,06 \u00c5, a N1 atom ima pozitivan parcijalan naboj (\u03b4+) zbog cijano- ili nitro- supstituenata koji su elektron-odvla\u010de\u0107e skupine. Semiempirijskim (PM3) i ab initio<\/em> izra\u010dunima zaklju\u010deno je kako taj parcijalni naboj nije izrazit i N1 atom mo\u017ee biti zamijenjen ugljikovim atomom, a da se pritom zadr\u017ei afinitet vezanja za receptor kukca i otrovnost insekticida (Zhang i sur., 2004.). Uo\u010deno je da piridin-3-ilmetilni supstituent (ili ekvivalentan) uvelike pove\u0107ava afinitet vezanja pa se mo\u017ee zaklju\u010diti da osim cijano- ili nitro- skupine i du\u0161ikovog atoma N1 va\u017ean doprinos daje i du\u0161ik u pridinskom prstenu.<\/p>\n Ponekad i druge molekulske zna\u010dajke mogu utjecati na selektivnost pa tako uvo\u0111enje azidne (-N3<\/sub>) ili amino (-NH2<\/sub>) skupine na poziciju 5 u 6-kloropiridin-3-ilnim neonikotinoidima rezultira smanjenjem vezanja (Tomizawa i Casida, 2005.), N-metilna skupina tiametoksama favorizira odre\u0111ene interakcije receptora pri ni\u017eoj temperaturi s u\u0161ima u odnosu na muhe dok intenzivnije vezanje kloropiridinilskih neonikotinoida u usporedbi s klorotiazolilnim ovisi o ostatku molekule. Pretpostavlja se kako se elektronegativni farmakofor neonikotinoida ve\u017ee za pozitivno nabijeni dio nikotin acetilkolinskog receptora kukca (npr. lizin, arginin ili histidin) i iako ne postoje izravni dokazi o stvarnoj poziciji ciljanog dijela molekule, ozna\u010davanje foto-afiniteta s odgovaraju\u0107im neonikotinoidnim ligandom u kombinaciji s ra\u010dunalnom simulacijom vezanja mo\u017ee pomo\u0107i u odre\u0111ivanju orijentacije elektronegativnog vrha neonikotinoida u aktivnom mjestu receptora.<\/p>\n <\/a> ▲<\/a><\/p>\n Neonikotinoidi se mogu upotrebljavati putem raznovrsnih formulacija i metoda primjene koje su efikasne u suzbijanju \u0161irokog spektra \u0161tetnika (Simon-Delso i sur., 2015.). Granule, natapanje tla, kemigacija ili folijarno prskanje neki su od naj\u010de\u0161\u0107ih na\u010dina kori\u0161tenja ovih insekticida, me\u0111u kojima svakako dominira tretiranje sjemena. \u010cesto se osim neonikotinoidima sjeme tretira i drugim pesticidima, regulatorima biljnog rasta ili nematicidima kako bi se vi\u0161estruko osigurao kvalitetan rast biljke i \u0161to ve\u0107i prinos plodova. Svojstva neonikotinoida poput relativno dugog vremena polu-\u017eivota u tlu i dobre topljivosti u vodi doprinosi postojanosti i prijenosu insekticida u okoli\u0161u (Bonmatin i sur., 2015.). Objavljene vrijednosti polu-\u017eivota za neonikotinoide u tlu kre\u0107u se od jednog dana do gotovo 19 godina na \u0161to utje\u010de vrsta tla, UV zra\u010denje, vlaga, temperatura i pH. Naj\u010de\u0161\u0107e se vrlo brzo razgrade, ali u slu\u010daju suhog tla s visokim udjelom organske tvari i pri niskim temperaturama, oni opstaju i potencijalno akumuliraju. S obzirom da su neonikotinoidi dobro topljive molekule u vodi, objavljeno je i mnogo radova njihovog ustvr\u0111ivanja u povr\u0161inskim i podzemnim vodama. Iako su otporni na hidrolizu pri neutralnom ili kiselom pH u anaerobnim uvjetima, uz dovoljnu prisutnost svjetla podlo\u017eni su brzoj fotodegradaciji, koja se smanjuje pove\u0107anjem mutno\u0107e vode (Thompson i sur., 2020.). Razlike u intenzitetu svjetlosti i temperaturi s promjenom zemljopisne \u0161irine izravno utje\u010du na vrijeme polu-\u017eivota po regijama, rezultiraju\u0107i s porastom vrijednosti udaljavaju\u0107i se od ekvatora (Bonmatin i sur., 2015.). Do kontaminacije vode mo\u017ee do\u0107i raznim putevima i mehanizmima, uklju\u010duju\u0107i pretjerano prskanje, \u0161irenje praha milovke i grafita od tretiranog sjemena, povr\u0161insko otjecanje, ispiranje u podzemne vode i topljenjem snijega (Thompson i sur., 2020.). Unato\u010d sveprisutnosti njihove pojave u vodi, objavljeno je tek nekoliko studija o procjeni rizika izlo\u017eenosti ljudi neonikotinoidima u vodi za ljudsku potro\u0161nju. Neonikotinoidi, zahvaljuju\u0107i maloj molekulskoj masi i visokoj topljivosti u vodi, relativno lako ulaze u biljna tkiva, gdje se prenose u pelud, vo\u0107e i povr\u0107e i samim time predstavljaju mogu\u0107i put izlo\u017eenosti ljudi jer pranjem ovih namirnica nije mogu\u0107e u potpunosti ukloniti neonikotinoidne insekticide.<\/p>\n Dva opse\u017ena istra\u017eivanja provedena u SAD-u i Kini upu\u0107uju da su neonikotinoidi postali sveprisutni u globalnoj opskrbi stanovni\u0161tva hranom (Lu i sur., 2018.). Dok je ameri\u010dkim istra\u017eivanjem ustvr\u0111en barem jedan neonikotinoid u 79 % vo\u0107a i 65 % povr\u0107a, u kineskom istra\u017eivanju je uo\u010den jedan ili vi\u0161e neonikotinoida u 57% vo\u0107a odnosno 63 % pretra\u017eivanog povr\u0107a. Tiametoksam (SAD-53 %; Kina-51 %) i imidakloprid (SAD-52 %; Kina-66 %) bili su naj\u010de\u0161\u0107e ustvr\u0111eni neonikotinoidni insekticidi u oba istra\u017eivanja. Romeh i sur. (2009.) ispitivali su postojanost imidakloprida u uzorcima raj\u010dica, gdje su zaklju\u010dili kako je mogu\u0107e mehani\u010dki (pranjem, guljenjem ko\u017ee) ukloniti barem dio neonikotinoida (7-30%), dok su i preradom raj\u010dica dobili ni\u017ee vrijednosti rezidua.<\/p>\n Shodno prisutnosti i postojanosti u svim navedenim okoli\u0161nim uzorcima neonikotinoidi predstavljaju ozbiljnu prijetnju o\u010duvanju p\u010delinjih zajednica, koje dolaze u izravan kontakt s njima putem one\u010di\u0161\u0107enog peluda, nektara ili vode jer ve\u0107 pri vrlo niskim koncentracijama mogu prouzro\u010diti poreme\u0107aje u njihovom pona\u0161anju i orijentaciji, a pri vi\u0161im i uginu\u0107e (Tlak Gajger i sur., 2016., 2017.). <\/a> ▲<\/a><\/p>\n Da bi se procijenila potencijalna opasnost po zdravlje ljudi i \u017eivotinja vrlo je va\u017eno prou\u010diti glavne transformacijske puteve neonikotinoida i proizvode koji nastaju u okoli\u0161u, uglavnom metaboli\u010dkim i fotokemijskim reakcijama. Mogu\u0107e su metaboli\u010dke pretvorbe i na drugim strukturnim dijelovima neonikotinoida koje rezultiraju promjenama u toksi\u010dnosti i insekticidnoj aktivnosti pa je tako uo\u010deno da je oksidacija nitrometilenskog ugljika kod nitiazina vrlo vjerojatno mehanizam koji dovodi do smanjenja toksi\u010dnosti (Tomizawa i Casida, 2005.). Hidroliza imidakloprida se provodi na jednom od dva metilenska supstituenta u imidazolidinskom dijelu molekule, nakon \u010dega slijedi formiranje olefina konjugacijom ili dehidratacijom uz minimalno ili bez otvaranja prstena, a pritom ostaje zadr\u017ean potencijal vezanja za nAChR kukca. Kloropiridinilmetilni, klorotiazolilmetilni i tetrahidrofuranmetilni supstituenti podlije\u017eu hidroksilaciji N-metilenske skupine i cijepanju, nakon toga se oksidacijom aldehida prevode do karboksilnih kiselina (6-kloronikotinska kiselina, 2-kloro-1,3-tiazol-5-karboksilna kiselina i 3-furoi\u010dna kiselina) koje se nakon konjugacije s glicinom ili glukuronskom kiselinom putem urina u sisavaca zbog svoje male molekulske mase i dobre topljivosti u vodi izlu\u010duju (Thompson i sur., 2020.).<\/p>\n Neonikotinoidi i njihovi metaboliti dugotrajno opstaju u okoli\u0161u te mogu djelovati sinergisti\u010dki zajedno s fungicidima, \u0161to im pove\u0107ava otrovnost za 1000 puta (Tlak Gajger i sur., 2016.). Otrovnost neonikotinoida ovisi i o na\u010dinu izlaganja pa je tako Cresswell (2011.) u meta-analizi iz 2011. godine o u\u010dincima djelovanja imidakloprida na 7073 odraslih p\u010dela i 36 zajednica u laboratorijskim i polu-kontroliranim uvjetima u p\u010delinjaku prikazao kako in vivo<\/em> istra\u017eivanje na otvorenom nije imalo smrtonosne u\u010dinke pri primjenjivanim dozama, ali je ipak rezultiralo smanjenim u\u010dinkom p\u010dela za 6 do 20 %. S druge strane, Blacqui\u00e8re i sur. (2012.) u svom preglednom radu opisuju laboratorijska istra\u017eivanja gdje su uo\u010deni smrtonosni i subletalni u\u010dinci na prikupljanje hrane te sposobnost u\u010denja i pam\u0107enja u p\u010dela. Toksi\u010dnost aktivnih tvari neonikotinoida za p\u010dele mjeri se vrijedno\u0161\u0107u LD50<\/sub> (letalna doza50<\/sub>) i\/ili LC50<\/sub> (letalna koncentracija50<\/sub>) koje se odre\u0111uju na osnovu ustvr\u0111enog broja uginulih p\u010dela nakon 24 do 48 sati po primjeni pojedinog neonikotinoida, me\u0111utim oralne LD50<\/sub> se razlikuju u raznim istra\u017eivanjima (Tlak Gajger i sur., 2017.).<\/p>\n <\/a> ▲<\/a><\/p>\n Zbog svojstava i velike uporabe diljem svijeta, za o\u010dekivati je da \u0107e se jednom kada se apliciraju na biljke neonikotinoidi mo\u0107i ustvrditi i u okoli\u0161u. Iz tog razloga, potrebno je procijeniti distribuciju neonikotinoida u okolini kako bi se dobio bolji uvid u razinu rizika koji oni predstavljaju za p\u010dele i ostale kukce opra\u0161iva\u010de. Da bi se istra\u017eila izlo\u017eenost p\u010dela pesticidima svakako je potrebno razvijanje prikladnih metoda odre\u0111ivanja njihovih rezidua, kako u p\u010deli tako i u p\u010delinjim proizvodima. Analizu ovih insekticida ote\u017eava raznolikost i slo\u017eenost vrsta uzoraka koje je potrebno analizirati u niskim koncentracijama u kojima su obi\u010dno prisutni. U tu svrhu laboratoriji moraju imati razvijenu i implementiranu multirezidualnu analiti\u010dku metodu za simultano odre\u0111ivanje \u0161to ve\u0107eg broja aktivnih supstanci koje naj\u010de\u0161\u0107e posjeduju raznolika fizikalno-kemijska svojstva. Samu metodologiju odre\u0111ivanja karakterizira \u0161irok spektar analita razli\u010ditih polarnosti, topljivosti, pKa vrijednosti, koncentracijskih razina te razli\u010dite vrste uzoraka koje utje\u010du na pojedine analite zbog razlika u udjelu vode, masti i biokemijskog sastava (Kne\u017eevi\u0107 i sur., 2010.). Postupci odre\u0111ivanja uklju\u010duju homogenizaciju uzorka s organskim otapalom ili smjesom organskog otapala, s vodom sa ili bez pode\u0161avanja pH vrijednosti uporabom homogenizatora ili ultrazvu\u010dnih mije\u0161alica, potom slijedi ekstrakcija spojeva iz uzoraka, pro\u010di\u0161\u0107avanje ekstrakta i kvantitativno odre\u0111ivanje analita primjenom kromatografskih tehnika.<\/p>\n Ekstrakcija na \u010dvrstom nosa\u010du (engl. Solid-phase extraction<\/em>, SPE) jest naj\u010de\u0161\u0107e kori\u0161tena metodologija za ekstrakciju i pro\u010di\u0161\u0107avanje neonikotinoidnih pesticida u p\u010delinjim proizvodima. Ciljani se analiti otopljeni u ekstrakcijskom otapalu nanose se na SPE kolonu, ve\u017eu za nepokretnu fazu, a potom se kako bi se uklonile interferiraju\u0107e tvari kolona ispire u odgovaraju\u0107im otapalima. Analiti se prikupe eluiranjem kolone otapalom u kojem su dobro topljivi. Sch\u00f6ning i Schmuck (2003.) prvi su upotrijebili SPE kolone punjene dijatomejskom zemljom za pro\u010di\u0161\u0107avanje uzoraka meda prilikom odre\u0111ivanja imidakloprida i dva metabolita (5-hidroksi- i olefin imiakloprid). Postoji nekoliko vrsta SPE kolona punjenih razli\u010ditim sorbensima koje se danas standardno koriste prilikom odre\u0111ivanja rezidua neonikotinoida, kao \u0161to su Strata C18, Oasis HLB, Strata-X i Strata X-CW. Upravo su ovu zadnju varijantu izabrali Gbylik-Sikorska i sur. (2015.) u svom radu gdje su odre\u0111ivali sedam neonikotinoida i \u0161est njihovih metabolita u medu, dok su prilikom analize uzoraka p\u010dela supernatant nakon ekstrakcije profiltrirali preko Sep-Pak Alumina N Plus Long patrona. Hou i sur. (2019.) su osim meda analizirali i uzorke mati\u010dne mlije\u010di koju izlu\u010duju mlade p\u010dele radilice. Uzorci su ekstrahirani smjesom metanola (MeOH) i vode (H2<\/sub>O), a nakon postupka centrifugiranja kako bi se istalo\u017eile bjelan\u010devine, koje \u010dine vi\u0161e od \u010detvrtine suhe tvari mati\u010dne mlije\u010di, supernatant se nanio na Oasis HLB kolone. Kolone su isprane smjesom MeOH:H2<\/sub>O (1:9, v\/v), a zatim su ciljani analiti eluirani \u010distim MeOH u staklene epruvete te nakon uparavanja do suhog, ekstrakt je rekonstituiran u metanol\/0,15 % mravlja kiselina (1:9, v\/v) i analiziran LC-MS\/MS tehnikom. Dobiveni su zadovoljavaju\u0107i ostatci (72,8\u2013106,5 %) i preciznost (RSD <13,8 %) za sve analite.<\/p>\n Va\u017ean matriks za procjenu izlo\u017eenosti pesticidima svakako je p\u010delinji vosak koji se u p\u010delarskoj praksi uobi\u010dajeno reciklira i u kojem je vrlo vjerojatna akumulacija okoli\u0161nih one\u010di\u0161\u0107iva\u010da (Tlak Gajger i sur., 2019.). Uglavnom se sastoji od ugljikovodika i estera te ima to\u010dku tali\u0161ta na otprilike 65 \u00b0C \u0161to ga \u010dini posebno zahtjevnim matriksom za razvijanje pouzdane i osjetljive analiti\u010dke metode. Uspore\u0111uju\u0107i NaCl s NaOAc nisu uo\u010dene velike razlike kod odre\u0111ivanja imidakloprida, njegovih metabolita te klotianidina, no u slu\u010daju ostalih neonikotinoida, acetat se pokazao kao bolji odabir u svrhu isoljivanja. Uzorci iz ko\u0161nice koji sadr\u017ee ve\u0107u koli\u010dinu lipidnih tvari, poput peluda i p\u010dela, zahtijevaju dodatan korak pro\u010di\u0161\u0107avanja, u svrhu minimiziranja matri\u010dnog efekta pa se to naj\u010de\u0161\u0107e provodi ektrakcijom teku\u0107e-teku\u0107e n<\/em>-heksanom ili DCM-om, no najbolji rezultati su zabilje\u017eeni tzv. freeze-out<\/em> postupkom gdje se nadtalog stavlja u posudu sa suhim ledom ili u zamrziva\u010d radi talo\u017eenja lipida i proteina. Iako je mnogo analiti\u010dkih tehnika (ELISA, plinska kromatografija, kapilarna elektroforeza, superkriti\u010dna fluidna kromatografija) primjenjivano za analizu neonikotinoidnih ineskticida, teku\u0107inska kromatografija uporabom C8 i C18 kolona obrnutih faza je svakako najprikladniji odabir za separaciju ovih tvari, uzimaju\u0107i u obzir njihova fizikalno-kemijska svojstva poput visoke polarnosti i niske hlapljivosti (Valverde i sur., 2016.).<\/p>\n Iako su objavljivani radovi s DAD detekcijom, masena spektormetrija (primarno tandemna \u2013 trostruki kvadrupol, QqQ) zbog ve\u0107e selektivnosti i osjetljivosti naj\u010de\u0161\u0107e je upotrebljavan detektor u metodama odre\u0111ivanja neonikotinoida, \u010dijom se uporabom dobivaju granice kvantifikacije u ppb (engl. parts per billion<\/em>) podru\u010dju s prihvatljivim iskori\u0161tenjem i RSD vrijednostima (Tu i Chen, 2020.). Zbog jedinstvenih karakteristika brzog na\u010dina rada i sposobnosti visokog razlu\u010divanja, TOF i Orbitrap analizatori masa su tako\u0111er kori\u0161teni za odre\u0111ivanje neonikotinoida. Zaklju\u010deno je da usprkos dobivanju ne\u0161to vi\u0161ih granica kvantifikacija u odnosu na QqQ, navedena tehnologija, je zahvaljuju\u0107i, vrlo preciznim izra\u010dunima masa idealan alat za odre\u0111ivanje neciljanih metabolita.<\/p>\n <\/a> 1. ABDOLLAHI, M., A. RANJBAR, S. SHADNIA, S. NIKFAR and A. REZAIE (2004): Pesticides and oxidative stress: a review. Med. Sci. Monit. 10, RA141-147. <\/a> ▲<\/a><\/p>\n The use of pesticides in agricultural cropping systems is often associated with mass extinction or honeybee colony`s population decline due to poisoning. Since the advantages of high toxicity for insects, low toxicity to vertrebrates, high efficacy and systemic activity in plants, in the last 20 years, neonicotinoid pesticides have become the most widely used class of insecticides. Key words:<\/strong> neonicotinoids; honeybees; toxicity; residues<\/em><\/p><\/blockquote>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Damir Pavli\u010dek*, Nina Biland\u017ei\u0107, Ivana Tlak Gajger i Marija Den\u017ei\u0107 Lugomer Damir PAVLI\u010cEK*, mag.chem., (dopisni autor, e-mail: pavlicek.vzk@veinst.hr), Hrvatski veterinarski<\/p>\n","protected":false},"author":8,"featured_media":0,"menu_order":5,"comment_status":"closed","ping_status":"open","template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[28],"tags":[982,981,983,162],"issuem_issue":[471],"ppma_author":[987,133,336,988],"class_list":["post-3374","article","type-article","status-publish","format-standard","hentry","category-review-articles","tag-medonosne-pcele","tag-neonikotinidi","tag-otrovnost","tag-rezidue","issuem_issue-52-5"],"yoast_head":"\n
\nDamir PAVLI\u010cEK<\/strong>*, mag.chem., (dopisni autor, e-mail: pavlicek.vzk@veinst.hr), Hrvatski veterinarski institut, Veterinarski zavod Kri\u017eevci, Hrvatska; dr. sc. Nina BILAND\u017dI\u0106<\/strong>, dipl. ing. preh. tehnol., znanstvena savjetnica, Hrvatski veterinarski institut Zagreb, Hrvatska; dr. sc. Ivana TLAK GAJGER<\/strong>, dr. med. vet., redovita profesorica, Veterinarski fakultet Sveu\u010dili\u0161ta u Zagrebu, Hrvatska; Marija DEN\u017dI\u0106 LUGOMER<\/strong>, dipl. ing. kemije, Hrvatski veterinarski institut, Veterinarski zavod Kri\u017eevci, Hrvatska<\/div>\n![\"\"](\"https:\/\/veterinarska-stanica-journal.hr\/wp-content\/uploads\/2021\/03\/pdf.png\")
<\/a>https:\/\/doi.org\/10.46419\/vs.52.5.12<\/a><\/div>\n<\/p>\nSa\u017eetak<\/a>Uvod<\/a>Razvoj i kemijska struktura neonikotinoida<\/a>Mehanizam djelovanja<\/a>Primjena i postojanost neonikotinoida u okoli\u0161u<\/a>Metabolizam i toksi\u010dnost<\/a>Odre\u0111ivanje rezidua neonikotinoida u p\u010delama i p\u010delinjim proizvodima<\/a>Literatura<\/a>Abstract<\/a><\/span><\/div>\n\n
Sa\u017eetak<\/h2>\n
\n
\nU ovom preglednom radu, osim glavnih karakteristika neonikotinoida, dan je uvid u razvoj i implementaciju pouzdanih analiti\u010dkih metoda za odre\u0111ivanje njihovih rezidua u p\u010delama i p\u010delinjim proizvodima, kao i izazov koji pritom predstavlja kompleksnost matrica zbog prisutnosti voska, proteina te drugih interferiraju\u0107ih tvari.<\/p>\nUvod<\/h2>\n
\n
\nZaslu\u017ene su i za o\u010duvanje bioraznolikosti samoniklih biljaka u prirodi, a danas su ugro\u017eenije nego ikada. Uz niz uzroka ugibanja s kojima se susre\u0107u (bolesti, nedostatci prirodne hrane, smanjivanje povr\u0161ina prirodnog okoli\u0161a) pa se stoga uporabi \u0161tetnih pesticida pridaje sve ve\u0107a uloga u velikim gubitcima p\u010delinjih zajednica diljem svijeta (Johnson i sur., 2010., Potts i sur., 2010.).<\/p>\n
\nUsprkos prvotnim uvjerenjima kako su neonikotinoidi slabo otrovni za sisavce, sve je vi\u0161e dokaza o raznim toksi\u010dnim u\u010dincima ovih tvari na \u017eivotinje i ljude (Phua i sur., 2009., Lonare i sur., 2014.).
\nNajpoznatiji primjer otrovanja korisnih kukaca neonikotinoidima zabilje\u017een je u ju\u017enoj Bavarskoj u travnju 2008. godine kada je unutar dva tjedna uginulo 11 500 p\u010delinjih zajednica (Stokstad, 2013.).
\nUstvr\u0111eno je kako je uzrok katastrofe one\u010di\u0161\u0107ena pra\u0161ina sa sjemenskog kukuruza tretiranog klotianidinom, pesticidom iz skupine neonikotinoida, zbog velike gre\u0161ke tvrtke koja je proizvodila sjeme, a nekontrolirano \u0161irila prilikom proljetne sjetve, a pritom nije upotrijebila tvari za vezanje pesticida i zrna. Iako se radilo o izdvojenom slu\u010daju, njema\u010dka je vlada reagirala i zabranila tretiranje kukuruza i jo\u0161 nekoliko drugih \u017eitarica klotianidinom. Godinu dana kasnije, Francuska je nakon \u0161to su p\u010delari zaklju\u010dili kako je otrovanje prouzro\u010dilo uginu\u0107e tre\u0107ine njihovih p\u010delinjih zajednica uvela zabranu uporabe imidakloprida na suncokretu.<\/p>\n
\nMe\u0111utim, proizvo\u0111a\u010di fitofarmaceutskih sredstava i dio poljoprivrednika zbog ote\u017eane provedbe za\u0161tite bilja i usjeva ovakvu su odluku ocijenili neprikladnom.
\nNa temelju daljnjih istra\u017eivanja utjecaja neonikotinoida na p\u010dele i ostale korisne kukce opra\u0161iva\u010de, koja su potvrdila veliku \u0161tetnost ovih spojeva za njihovo zdravlje, 27. travnja 2018. godine Stalni odbor za biljke, \u017eivotinje, hranu i hranu za \u017eivotinje donio je odluku kojom se u potpunosti zabranjuje uporaba klotianidina, imidakloprida i tiametoksama na svim otvorenim povr\u0161inama, uz izuzetak staklenika, u zemljama \u010dlanicama Europske unije (EC, 2018.a, 2018.b, 2018.c). EFSA je po\u010detkom 2019. godine objavila izvje\u0161\u0107e o procjeni \u0161tetnosti pesticida tiakloprida (EC, 2019.) temeljem kojeg je 03. velja\u010de 2020. godine odlu\u010deno kako i taj predstavnik neonikotinoida ne\u0107e dobiti daljnje odobrenje za uporabu na podru\u010dju Europske unije. U slu\u010daju acetamiprida ustvr\u0111en nizak rizik za p\u010dele i obnovljeno je odobrenje do 28. velja\u010de 2033. godine (EC, 2018.d).<\/p>\nRazvoj i kemijska struktura neonikotinoida<\/h2>\n
\n
\nAmeri\u010dki kemi\u010dar Henry Feuer sintetizirao je spoj 2-[dibrom(nitro)metil]-3-metilpiridin s insekticidnim djelovanjem na muhe i \u0161tetnike gra\u0161ka. To je bio prekursor za sintezu (E\/Z<\/em>)-2-nitrometilen-1,3-thiazinana, poznatijeg kao nitiazin, nitrometilenskog neonikotinoidnog insekticida koji je u\u010dinkovito djelovao protiv kukuruzne u\u0161i i pokazivao nisku toksi\u010dnost za sisavce, ali zbog nedovoljne fotokemijske stabilnosti, \u0161to ote\u017eava \u0161iroku primjenu u poljoprivredi, nikada nije komercijaliziran (Majdan\u010di\u0107 i sur., 2017.). Zamjenom nitrometilenske skupine s fotostabilnom nitroiminskom skupinom, tvrtka Bayer CropScience 1985. godine sintetizirala je spoj imidakloprid ([1-(6-kloro-3-piridilmetil)-N-nitroimidazolidin-2-ilidenamin]), prvi komercijalan neonikotinoid koji se odlikuje visokom insekticidnom aktivno\u0161\u0107u, niskom postojanosti u tlu i niskom toksi\u010dnosti u sisavaca. Nakon registracije imidakloprida 1992. godine, kroz sljede\u0107ih 10 godina jo\u0161 je \u0161est neonikotinoida se pojavilo na tr\u017ei\u0161tu \u2013 acetamiprid 1995. god., nitenpiram 1995. god., tiametoksam 1998. god., tiakloprid 2000. god., klotianidin 2001. god. i dinotefuran 2002. god. (Slika 1.), \u0161to \u010dini neonikotinoide najbr\u017ee rastu\u0107om klasom insekticida.<\/p>\n![\"\"](\"https:\/\/veterinarska-stanica-journal.hr\/wp-content\/uploads\/2021\/04\/slika01-uporaba-neonikotinoida.jpg\")
\nKina kao najve\u0107i svjetski proizvo\u0111a\u010d, potro\u0161a\u010d i izvoznik neonikotinoida ima glavnu ulogu u razvoju ovih kemijskih tvari.<\/p>\nMehanizam djelovanja<\/h2>\n
\n
\nAcetilkolin esteraza, enzim koji razgra\u0111uju acetilkolin, nije sposoban u\u010diniti isto i s neonikotinoidima, \u0161to pri niskim koncetracijama dovodi do \u017eiv\u010dane stimulacije i blokade receptora, a pri visokim koncentracijama dovodi do paralize i uginu\u0107a kukca (Tomizawa i Casida, 2005.). Nikotin acetilkolinski receptori nisu isklju\u010divo u ciljanim \u0161tetnicima ve\u0107 ih ima i u kralje\u017enjaka i beskralje\u0161njaka. Pa se tako nAChR nalaze u ljudi u perifernom i u centralnom \u017eiv\u010danom sustavu gdje prenose impulse do skeletnih mi\u0161i\u0107a da bi izazvali podra\u017eaj, dok u kukaca njihova uloga nije potpuno razja\u0161njena kao u ljudi, ali su odgovorni i za postsinapti\u010dku neurotransmisiju. Za razliku od sisavaca, ovi receptori se u kukaca nalaze ponajprije u centralnom \u017eiv\u010danom sustavu i to u mnogo ve\u0107em broju. Upravo je to jedan od razloga ja\u010de interakcije neonikotinoida i kukaca u odnosu na one s kralje\u017enjacima. Smatra se da su otprilike 5 do 10 puta selektivniji za kukce u odnosu na organofosfate, metilkarbamate i organoklorine. Ta se selektivna toksi\u010dnost pripisuje i razli\u010ditoj osjetljivosti podvrsta nAChR u kukaca i kralje\u017enjaka. U kukaca, neonikotinoidi djeluju na najmanje tri razli\u010dite podjedinice receptora nikotin acetilkolina prouzro\u010duju\u0107i bifazni u\u010dinak.<\/p>\n![\"\"](\"https:\/\/veterinarska-stanica-journal.hr\/wp-content\/uploads\/2021\/04\/slika02-uporaba-neonikotinoida.jpg\")
Primjena i postojanost neonikotinoida u okoli\u0161u<\/h2>\n
\n
\nRezidue neonikotinoida prona\u0111eni su u zrncima peluda, u fermentiranom peludu pohranjenom u sa\u0107u, u zrelom medu te u vrcanom medu kao finalnom proizvodu \u0161to dovoljno govori o otpornosti i stabilnosti ovih insekticida.<\/p>\nMetabolizam i toksi\u010dnost<\/h2>\n
\n
\nOvim procesima, ovisno o mehanizmu nastajanja, mogu nastati identi\u010dni ili razli\u010diti proizvodi. U ve\u0107ini slu\u010dajeva do promjenjene bioaktivnosti dolazi uslijed transformacija cijano- i nitro- funkcionalnih skupina (farmakofora) koje su bogate elektronima. Nitro skupina se mo\u017ee transformirati prvo u desnitro gvanidinski metabolit, a potom u urejski metabolit (Thompson i sur., 2020.). Desnitro oblik je zbog raspodjele pozitivnog naboja na gvanidinu koji spremno reagira s nAChR sisavaca bitno otrovniji za kralje\u017enjake. Cijano-funkcionalna skupina se \u010dini dosta stabilnija od nitro- skupine \u0161to je primjerice vidljivo kod fotolize gdje za razliku od tiametoksama, imidakloprida i klotianidina (nitro-neonikotinoidi) kod kojih dolazi do fotodegradacije molekula, cijano-neonikotionidi \u2013 acetamiprid i tiakloprid, su na sun\u010devoj svjetlosti stabilni.<\/p>\n
\nPra\u0107enjem N<\/em>-demetilacije nekih neonikotionida (imidakloprid, nitenpiram, tiaametoksam) uo\u010dena je pove\u0107ana insekticidna i\/ili receptorska aktivnost. Tiametoksam se jednostavno prevodi u klotianidin hidroksilacijom metilenske skupine u prstenu u kukaca i biljaka, pri \u010demu klotianidin podlije\u017ee N<\/em>-demetilaciji. Kod tiakloprida dolazi do otvaranja tiazolidinskog prstena, a atom sumpora se potom oksidira i metilira.
\nAcetamiprid uz N<\/em>-demetilaciju ima i cijepanje veze s N<\/em>-cijanoacetamidom u biljkama.
\nKod dinotefurana, hidroksilacija tetrahidrofuranskog dijela dovodi do otvaranja prstena i osloba\u0111anja aldehida koji tvori ciklizirane derivate. Nitrogvanidinska (C=N-NO2<\/sub>) polovina imidakloprida se reducira do nitrozogvanidina (C=N-NO) i aminogvanidina (C=N-NH2<\/sub>), a cijepanjem nastaju gvanidinski (C=NH) i ureja (C=O) derivati. Nitrozogvanidinski metabolit imidakloprida posjeduje jaku insekticidnu aktivnost za razliku od gvanidinskog metabolita koji pokazuje potentno djelovanje samo za sisavce.
\nHidrolizom C=N-CN strukturne jedinice tiakloprida nastaje amid C=NC(O)NH2<\/sub>, a nakon toga se tako\u0111er cijepa veza N-CN.
\nDescijanotiakloprid jest osobito potentan agonist nAChR sisavaca.<\/p>\n
\nMapiranjem cjelokupnog genoma p\u010dela otkriveno je da receptori nikotin acetilkolina imaju 11 podjedinica u njihovom \u017eiv\u010danom sustavu, \u0161to je mnogo vi\u0161e nego u komarca ili vinske mu\u0161ice i samim time je neurotoksi\u010dan u\u010dinak neonikotinoida i njihovih metabolita mnogo ja\u010di.<\/p>\n
\nKako ovi u\u010dinci istra\u017eivanjima na terenu nisu dokazani, brojni radovi sugeriraju kako nije mogu\u0107e potvrditi isklju\u010divi utjecaj uporabe neonikotinoida na \u017eivot p\u010dela zbog jednostranog promatranja problema i nedostatka pouzdanih informacija o ranijim pojavama pomora p\u010dela prije globalne uporabe ovih insekticida (Majdan\u010di\u0107 i sur., 2017.).
\nVe\u0107ina laboratorijskih istra\u017eivanja fokusira se na utjecaj neonikotinoida na pojedine jednike p\u010dela, iako u\u010dinci djelovanja mogu biti druga\u010diji ukoliko se p\u010delinja zajednica promatra u cjelini.
\nOsim utjecaja vanjskih \u010dimbenika potrebno je uzeti u obzir i utjecaj populacije p\u010delinjih zajednica izra\u017een kroz promjenu odnosa broja trutova i radilica u pojedinim razdobljima razvoja i proizvodnosti jer se ovaj odnos ovisno o stanju pa\u0161e i raspolo\u017eivosti prirodne hrane dinami\u010dno mijenja.<\/p>\nOdre\u0111ivanje rezidua neonikotinoida u p\u010delama i p\u010delinjim proizvodima<\/h2>\n
\n
\nNakon eluiranja s diklormetanom (DCM), sadr\u017eaj je dodatno po\u010di\u0161\u0107en na koloni sa silikagelom, ispran smjesom otapala toluen-etil acetat te eluiran s acetonitrilom (ACN).
\nDetekcija je provedena teku\u0107inskom kromatografijom spregnutom s tandemnom spektrometrijom masa (LC-MS\/MS pri \u010demu su postignute granice kvantifikacije od 5-10 \u00b5g\/kg.<\/p>\n
\nZa eluaciju je kori\u0161tena smjesa otapala ACN i etil acetata (8:2, v\/v) koja se potom uparila u struji du\u0161ika, a suhi ostatak je otopljen u minimalnoj koli\u010dini vode prije LC-MS\/MS analize. Za sve obuhva\u0107ene analite granice kvantifikacije su se kretale u podru\u010dju 0,1 do 0,5 \u00b5g\/kg, a dobiveni su ostatci od 89 do 112 %, zadovoljavaju\u0107i kriterije SANTE dokumenta (2019.) (70-120 %).<\/p>\n
\nY\u00e1\u00f1ez i sur. (2013.) su opisali razvijanje jedne takve metode. Istaknuli su kako je vrlo va\u017eno prilikom oboga\u0107ivanja neonikotinoidima zagrijati vosak na temperaturu od 70 \u00b0C kako bi se zadr\u017eala homogenost uzoraka. Za njihovo otapanje koristila se smjesa heksana i izopropanola (8:2, v\/v), pri \u010demu je izopropanol dodan radi bolje ekstrakcije neonikotinoida. Potom se dodaje voda u svrhu razdijeljenja i ekstrakciju analita u vodeni sloj. Nakon \u0161to se vodeni ekstrakt nanese na SPE kolone s dijatomejskom zemljom, eluacija se provodi s acetonom jer se tim otapalom dobivaju najbolji ostatci, a i vrlo jednostavno ga je upariti.
\nZa uzorke u kojima se odre\u0111uje ve\u0107i broj neonikotinoidnih metabolita, pokazalo se kako je bolja opcija koristiti SPE kolone s C18 sorbensom umjesto slabog anionskog izmjenjiva\u010da koji sadr\u017ei i primarne i sekundarne amine (PSA). U tom slu\u010daju, dodatak trietilamina u otapalo kojim se eluira, naj\u010de\u0161\u0107e ACN, pospje\u0161uje desorpciju metabolita s C18 kolona (Kamel, 2010.). PSA sorbens se uobi\u010dajeno koristi u koraku disperzivne ekstrakcije na \u010dvrstom nosa\u010du (d-SPE) QuEChERS metode za ko-ekstrakciju interferiraju\u0107ih tvari iz matriksa, ponajvi\u0161e \u0161e\u0107era. Kod QuEChERS protokola, u prvom koraku se dodavaju soli, uglavnom MgSO 4 i NaCl, u uzorak koji se ekstrahira smjesom ACN i vode kako bi se potaknulo razdvajanje slojeva. Tu i Chen (2020.) su u svom preglednom radu analiti\u010dkih metoda za odre\u0111ivanje neonikotinoidnih pesticida u p\u010delama i p\u010delinjim proizvodima opisali nekoliko studija koje su koriste\u0107i razne modifikacije QuEChERS tehnike dobili vrlo zadovoljavaju\u0107e rezultate.
\nPrimije\u0107eno je kako se dodatkom i citratnih soli u prvom koraku dobivaju ve\u0107i ostatci neonikotinoida, uz kvalitetnije kromatografsko razdvajanje i rezoluciju pikova na LC-MS\/MS instrumentu.<\/p>\n
\nLiteratura<\/strong> [… prika\u017ei]<\/span><\/a><\/span><\/p>\n ▲<\/a><\/p>\n
\n2.\tBLACQUI\u00c8RE, T., G. SMAGGHE, C. A. VAN GESTEL and V. MOMMAERTS (2012): Neonicotinoids in bees: a review on concentrations, side-effects and risk assessment. Ecotoxicology 21, 973-992.
\n3.\tBONMATIN, J. M., C. GIORIO, V. GIROLAMI, et al. (2015): Environmental fate and exposure; neonicotinoids and fipronil. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 22, 35-67.
\n4.\tCHAUZAT, M.-P., P. CARPENTIER, A.-C. MARTEL, S. BOUGEARD, N. COUGOULE, P. PORTA, J. LACHAIZE, F. MADEC, M. AUBERT and J.-P. FAUCON (2009): Influence of pesticide residues on honey bee (Hymenoptera: Apidae) colony health in France. Environ. Entomol. 38, 514-523.
\n5.\tCRESSWELL, J. E. (2011): A meta-analysis of experiments testing the effects of a neonicotinoid insecticide (imidacloprid) on honey bees. Ecotoxicology 20,149-157.
\n6.\tEC (2013): Commission implementing regulation (EU) No 485\/2013 of 24 May 2013 amending Implementing Regulation (EU) No 540\/2011, as regards the conditions of approval of the active substances clothianidin, thiamethoxam and imidacloprid, and prohibiting the use and sale of seeds treated with plant protection products containing those active substances. Off. J. Eur. Commun. L139, 12-26.
\n7.\tEC (2018a): Commission implementing regulation (EU) 2018\/783 of 29 May 2018 amending Implementing Regulation (EU) No 540\/2011 as regards the conditions of approval of the active substance imidacloprid. Off. J. Eur. Commun. L132, 31-34.
\n8.\tEC (2018b): Commission implementing regulation (EU) 2018\/784 of 29 May 2018 amending Implementing Regulation (EU) No 540\/2011 as regards the conditions of approval of the active substance clothianidin. Off. J. Eur. Commun. L132, 35-39.
\n9.\tEC (2018c): Commission implementing regulation (EU) 2018\/785 of 29 May 2018 amending Implementing Regulation (EU) No 540\/2011 as regards the conditions of approval of the active substance thiamethoxam. Off. J. Eur. Commun. L132, 40-44.
\n10.\tEC (2018d): Commission implementing regulation (EU) 2018\/113 of 24 January 2018 renewing the approval of the active substance acetamiprid in accordance with Regulation (EC) No 1107\/2009 of the European Parliament and of the Council concerning the placing of plant protection products on the market, and amending the Annex to Commission Implementing Regulation (EU) No 540\/2011. Off. J. Eur. Commun. L20, 7-10.
\n11.\tEFSA (2019): Peer review of the pesticide risk assessment of the active substance thiacloprid. EFSA Journal 17, 5595.
\n12.\tGBYLIK-SIKORSKA, M., T. SNIEGOCKI and A. POSYNIAK (2015): Determination of neonicotinoid insecticides and their metabolites in honey bee and honey by liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B 990, 132-140.
\n13.\tGIORIO, C., A. SAFER, F. S\u00c1NCHEZ-BAYO, A. TAPPARO, A. LENTOLA, V. GIROLAMI, M. B. VAN LEXMOND and J.-M. BONMATIN (2017): An update of the worldwide integrated assessment (WIA) on systemic insecticides. Part 1: new molecules, metabolism, fate, and transport. Environ. Sci. Pollut. Res. 28,11716-11748.
\n14.\tHOU, J., W. XIE, D. HONG, W. ZHANG, F. LI, Y. QIAN and C. HAN (2019): Simultaneous determination of ten neonicotinoid insecticides and two metabolites in honey and Royal- jelly by solid\u2212phase extraction and liquid chromatography\u2212tandem mass spectrometry. Food Chem. 270, 204-213.
\n15.\tIWASA, T., N. MOTOYAMA, J. AMBROSE and R. M. ROE (2004): Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee. J. Crop Prot. 23, 371-378.
\n16.\tJAB\u0141O\u0143SKA-TRYPU\u0106, A. (2017): Pesticides as inducers of oxidative stress. React. Oxyg. Species 3, 96-110.
\n17.\tJESCHKE, P., R. NAUEN, M. SCHINDLER and A. ELBERT (2011): Overview of the status and global strategy for neonicotinoids. J. Agric. Food Chem. 59, 2897-2908.
\n18.\tJOHNSON, R. M., M. D. ELLIS, C. A. MULLIN and M. FRAZIER (2010): Pesticides and honey bee toxicity \u2013 USA*. Apidologie 30, 235-248.
\n19.\tKAMEL, A. (2010): Refined methodology for the determination of neonicotinoid pesticides and their metabolites in honey bees and bee products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS\/MS). J. Agric. Food Chem. 58, 5926-5931.
\n20.\tKNE\u017dEVI\u0106, Z., N. BILAND\u017dI\u0106, M. \u0110OKI\u0106 i M. SEDAK (2010): Sigurnost hrane i pesticidi. Vet. stn. 41, 303-309.
\n21.\tKRUPKE, C. H., G. J. HUNT, B. D. EITZER, G. ANDINO and K. GIVEN (2012): Multiple routes of pesticide exposure for honeybees living near agricultural fields. PloS ONE 7(1), e29268.
\n22.\tLONARE, M., M. KUMAR, S. RAUT, P. BADGUJAR, S. DOLTADE and A. TELANG (2014): Evaluation of imidacloprid-induced neurotoxicity in male rats: A protective effect of curcumin. Neurochem. Int. 78, 122-129.
\n23.\tLU, C., C.-H. CHANG, C. PALMER, M. ZHAO and Q. ZHANG (2018): Neonicotinoid residues in fruits and vegetables: An integrated dietary exposure assessment approach. Environ. Sci. Technol. 52, 3175-3184.
\n24.\tLUSHCHAK, V. I., T. M. MATVIISHYN, V. V. HUSAK, J. M. STOREY and K. B. STOREY (2018): Pesticide toxicity: a mechanistic approach. EXCLI. J. 17, 1101-1136.
\n25.\tMAJDAN\u010cI\u0106, M., B. MUHI\u0106 i M. BA\u0160I\u0106 (2017): Utjecaj neonikotinoida na p\u010delarstvo. Zbornik radova i sa\u017eetaka sa drugog kongresa o p\u010delarstvu i p\u010delinjim proizvodima sa me\u0111unarodnim u\u010de\u0161\u0107em \u2013 P\u010delarstvo i p\u010delinji proizvodi 2, 54-62.
\n26.\tPHUA, D. H., C. C. LIN, M. L. WU, J. F. DENG and C. C. YANG (2009): Neonicotinoid insecticides: an emerging cause of acute pesticide poisoning. Clin. Toxicol. (Phila). 47, 336-341.
\n27.\tPOTTS, S. G., J. C. BIESMEIJER, C. KREMEN, P. NEUMANN, O. SCHWEIGER and W.E . KUNIN (2010): Global pollinator declines: trends, impacts and drivers. Trends Ecol. Evol. 25, 345-353.
\n28.\tRASZEWSKI, G., M. K. LEMIESZEK, K. \u0141UKAWSKI, M. JUSZCZAK and W. RZESKI (2015): Chlorpyrifos and cypermethrin induce apoptosis in human neuroblastoma cell line SH\u2010 SY 5 Y. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 116, 158-167.
\n29.\tROMEH, A. A., T. M. MEKKY, R. A. RAMADAN and M. Y. HENDAWI (2009): Dissipation of profenofos, imidacloprid and penconazole in tomato fruits and products. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 83, 812.
\n30.\tSANTE (2019): Guidance SANTE\/12682\/2019 \u2013 Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticides residues analysis in food and feed.
\n31.\tSCH\u00d6NING, R. and R. SCHMUCK (2003): Analytical determination of imidacloprid and relevant metabolite residues by LC MS\/MS. B. Insectol. 56, 41-50.
\n32.\tSEIFERT, J. (2014): Neonicotinoids. Encyclopedia of Toxicology (Third Edition). 477-482.
\n33.\tSIMON-DELSO, N., V. AMARAL-ROGERS, L. P. BELZUNCES, et al. (2015): Systemic insecticides (neonicotinoids and fipronil): trends, uses, mode of action and metabolites. Environ. Sci. Pollut. Res. 22, 5-34.
\n34.\tSTOKSTAD, E. (2013): Pesticides under fire for risks to pollinators. Science 340 (6133), 674-676.
\n35.\tTHOMPSON, D. A., H. J. LEHMLER, D. W. KOLPIN, et al. (2020): A critical review on the potential impacts of neonicotinoid insecticide use: current knowledge of environmental fate, toxicity, and implications for human health. Environ. Sci. Process Impacts. 22, 1315-1346.
\n36.\tTLAK GAJGER, I., I. BOSEK, N. BILAND\u017dI\u0106 i M. KOSANOVI\u0106 (2016): Utjecaj neonikotinoida na kukce opa\u0161iva\u010de. Vet. stn. 47, 353-363.
\n37.\tTLAK GAJGER, I., M. SAKA\u010c and A. GREGORC (2017): Impact of thiamethoxam on honey bee qeeen (Apis mellifera) reproductive morphology and physiology. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 99, 3, 297-302.
\n38.\tTLAK GAJGER, I., M. KOSANOVI\u0106, V. ORE\u0160\u010cANIN, S. KOS and N. BILAND\u017dI\u0106 (2019): Mineral content in honeybee wax combs as a measurement of the impact of environmental factors. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 103, 697-703.
\n39.\tTOMIZAWA, M., N. ZHANG, K. A. DURKIN, M. M. OLMSTEAD and J. E. CASIDA (2003): The neonicotinoid electronegative pharmacophore plays the crucial role in the high affinity and selectivity for the Drosophila nicotinic receptor: an anomaly for the nicotinoid cation-\u03c0 interaction model. Biochemistry 42, 7819-7827.
\n40.\tTOMIZAWA, M. and J. E. CASIDA (2005): Neonicotinoid insecticide toxicology: mechanisms of selective action. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 45, 247-268.
\n41.\tTU, X. and W. CHEN (2020): Overview of analytical methods for the determination of neonicotinoid pesticides in honeybee products and honeybee. Crit. Rev. Anal. Chem. 19, 1-10.
\n42.\tVALVERDE, S., J. L. BERNAL, M. T. MART\u00cdN, M. J. NOZAL and J. BERNAL (2016): Fast determination of neonicotinoid insecticides in bee pollen using QuEChERS and ultra-high performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Electrophoresis 37, 2470-2477.
\n43.\tY\u00c1\u00d1EZ, K. P., J. L. BERNAL, M. J. NOZAL, M. T. MARTIN and J. BERNAL (2013): Determination of seven neonicotinoid insecticides in beeswax by liquid chromatography coupled to electrospray-mass spectrometry using a fused-core column. J. Chromatogr. A 1285, 110-117.
\n44.\tZHANG, N., M. TOMIZAWA and J. E. CASIDA (2004): \u03b1-Nitro ketone as an electrophile and nucleophile: synthesis of 3-substituted 2-nitromethylenetetrahydrothiophene and -tetrahydrofuran as Drosophila nicotinic receptor probes. J. Org. Chem. 69, 876-881.
\n<\/em><\/p>\n<\/div>\n\n
Use of neonicotinoids and monitoring of its residues in honeybees and honeybee products<\/h2>\n
\nDamir PAVLI\u010cEK<\/strong>, M.Chem, Croatian Veterinary Institute, Veterinary Department Kri\u017eevci, Kri\u017eevci, Croatia; Nina BILAND\u017dI\u0106<\/strong>, BSc, PhD, Scientific Advisor, Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia; Ivana TLAK GAJGER<\/strong>, DVM, Full Professor, Faculty of Veterinary Medicine University of Zagreb, Croatia; Marija DEN\u017dI\u0106 LUGOMER<\/strong>, BSc, Croatian Veterinary Institute, Veterinary Department Kri\u017eevci, Kri\u017eevci, Croatia<\/div>\n
\n
\nIn basic structure, they possess either a nitromethylene, nitroimine, or cyanoimine functional group while their prime member is imidacloprid, the second most used pesticide in the world, after glyphosate. By mode of action, neonicotinoids are considered as agonists on the postsynaptic nicotinic acetylcholine receptor of the insect`s central nervous system, causing a blockage of signal transmission, resulting with disorientation, paralysis or even death. Residues of neonicotinoids can be present in the plan pollen and nectar, main natural food source for honeybees, which honeybees collect and store into the hives. Numerous studies have demonstrated that concentrations of these insecticides have a negative affect on honeybees` behaviour and health. In response to this concerns, in the past three years, based on peer review of the pesticide risk assessment of these substances, the European Commission have prohibit the use of clothianidin, imidacloprid, thiametoxam and thiacloprid for all outdoor uses in member states, except for their use in greenhouses.
\nThis review paper provides insight into main properties of neonicotinoids, as well as development and implementation of reliable analytical methods for determination of their residues in honey bees and bee products and challenges faced during due to the complex matrices which contain beeswax, proteins and other interfering compounds.<\/p>\n